엑손 - 운남 ATM 히터 유한 공사

Scientific Reports 6권, 기사 번호: 18741(2016) 이 기사 인용

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ATM은 DNA 손상 반응(DDR) 경로의 중요한 정점 키나제를 암호화하는 중요한 암 감수성 유전자입니다. 우리는 ATM의 핵심 넌센스 매개 RNA 붕괴 스위치 엑손(NSE)이 U2AF, PUF60 및 hnRNPA1에 의해 억제된다는 것을 보여줍니다. NSE 활성화는 일배체형 특이적이었고 NSE 3' 스플라이스 부위(3'ss)의 rs609261에서 시토신에 의해 가장 촉진되었으며, 이는 암 위험이 높은 집단에서 우세합니다. NSE 수준은 백혈병에서 규제가 완화되었으며 U2AF35 잔기 34의 정체성에 의해 영향을 받았습니다. 또한 NSE 수준을 조절하기 위해 인접한 pseudoexon의 경쟁을 이용하는 스플라이스 전환 올리고뉴클레오티드(SSO)를 식별합니다. ATM 신호 전달 경로에서 U2AF가 조절하는 엑손 사용은 MRN/ATM-CHEK2-CDC25-cdc2/cyclin-B 축에 집중되어 있으며 암 관련 유전자 융합 및 염색체 전좌와 관련된 전사물에 우선적으로 관여합니다. 이러한 결과는 3'ss 제어와 이중 가닥 DNA 절단에 대한 ATM 의존적 반응 사이의 중요한 연관성을 밝히고, 인트론 변이체의 기능적 가소성을 입증하며, pseudo-3'ss를 표적으로 삼아 유전자 발현을 수정하는 인트론 SSO의 다양성을 보여줍니다.

인트론은 스플라이스솜(spliceosome)이라고 불리는 크고 매우 역동적인 RNA-단백질 복합체에 의해 제거되며, 이는 1차 전사체, 작은 핵 RNA(snRNA) 및 다수의 단백질 사이의 복잡한 상호작용을 조율합니다1. 스플라이시오좀은 U1 snRNA에 의한 5' 스플라이스 부위(5'ss) 또는 U2 보조 인자의 결합과 관련된 U2 경로1,2에 의한 3'ss의 인식을 시작으로 순서대로 각 인트론에 임시 조립됩니다( U2AF)를 3'ss 영역에 추가하여 분기점 서열(BPS)3의 U2 인식을 용이하게 합니다. U2AF는 U2AF2로 인코딩된 65-kD 서브유닛(U2AF65)으로 구성된 안정적인 이종이합체로 폴리피리미딘 트랙(PPT)과 U2AF1로 인코딩된 35-kD 서브유닛(U2AF35)이 결합하며 3'에서 고도로 보존된 AG 디뉴클레오티드와 상호작용합니다. ss를 사용하고 U2AF65 바인딩을 안정화합니다4. BPS/PPT 장치 및 3'ss/5'ss 외에도 정확한 스플라이싱에는 인트론 또는 엑소닉 스플라이싱 인핸서 또는 소음기라고 알려진 스플라이스 부위 인식을 활성화하거나 억제하는 보조 시퀀스 또는 구조가 필요합니다. 이러한 요소를 사용하면 고등 진핵생물의 게놈에 있는 엄청나게 많은 비밀 또는 의사 사이트 중에서 실제 스플라이스 사이트를 인식할 수 있습니다. 이 사이트는 유사한 서열을 가지고 있지만 실제 사이트보다 훨씬 많습니다5. 그들은 종종 규제 기능을 가지고 있지만6, 억제의 분자 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다.

엑솜 시퀀싱 연구에서는 SF3B1, ZRSR2, SF1, SF3A1, PRPF40B 및 SRSF2를 포함하여 U2AF1/U2AF2 및 암세포의 3'ss 인식에 관여하는 기타 유전자의 체세포 돌연변이의 제한된 패턴이 밝혀졌습니다(7에서 검토). 이 유전자는 스플라이스솜 조립 중에 종종 상호작용하는 산물을 암호화하고 암 관련 돌연변이의 높은 수준의 상호 배타성을 나타내며 공유된 발암 경로의 존재를 나타냅니다. 이러한 돌연변이를 가지고 있는 백혈병의 전사체 프로파일링은 mRNA 전구체의 스플라이싱에서 수많은 변경을 감지했지만7, 치료 조절을 위한 이러한 목표의 큰 가능성에도 불구하고 특정 RNA 처리 결함과 암 시작 또는 진행 사이의 주요 연결은 여전히 모호한 상태로 남아 있습니다. 또한, 이들 세포에서 고도로 제한된 돌연변이 패턴이 발암성 특성을 갖는 제한적이고 명확하게 정의된 RNA 처리 결함 세트와 연관되지 않은 이유가 불분명합니다. 더욱이, 악성 형질전환에서 중요한 역할을 하는 DDR 유전자의 엑손 사용은 3'ss 처리 인자가 결여된 세포에서 완전히 특성화되지 않았으며 활성화에 영향을 미치는 천연 DNA 변종도 알려져 있지 않습니다.

TAG>AAG>GAG hierarchy of exon inclusion levels at the 3′ss consensus15. To confirm that the NSE usage is allele-specific, we examined splicing of two reporter constructs that contained C or T at this position following transient transfections into HEK293 cells (Fig. 2b). As expected, the T construct yielded lower NSE inclusion than the C reporter, both in untreated cells and cells individually depleted of each U2AF subunit (Fig. 2c)./p>G13. We noticed that this mutation activated the NSE 3′ss while repressing its 5’ss and promoting a downstream 5’ss instead, introducing a 112-nt cryptic exon in the mRNA13. We also noticed that within this exon, there was a strong 3′ss consensus preceded by optimal BPS/PPT motifs, which may bind U2AF and activate a smaller, 24-nt pseudoexon (termed PE; Fig. 4a). Examination of published RNA crosslinking/immunoprecipitation data20 in ATM showed U2AF65 binding upstream and downstream of NSE and upstream of PE, suggesting that NSE activation may be controlled by competition between partially productive spliceosomes assembled at the PE 3′ss and the NSE 3′ss. The two 3′ss are conserved in mammals and are separated by a distance smaller than the minimal intron size, sterically preventing simultaneous recognition of NSE and PE (Fig. 4a). Deletion of the PE PPT/3′ss introduced in the C minigene, which should alleviate NSE repression through diminished U2AF binding to PE, increased NSE inclusion (Fig. 4b), in agreement with the 3′ss competition. This deletion also induced retention of the intron that separates NSE and PE, mimicking the splicing pattern of the A-T mutation IVS28-159A >G. Increasing the intron length from 59 to 79 nt, thereby overcoming a steric hindrance imposed by the insufficient distance between the two pseudo-3′ss, also improved NSE inclusion and diminished the intron retention (Fig. 4b)./p>G substitution13. In this A-T case, both NSE and PE were included in the ATM mRNA together with the intervening sequence. Canonical and aberrant transcripts are denoted by dotted lines above and below the pre-mRNA. Middle panel shows RNA-Seq read densities for NSE in cells depleted of both U2AF35 isoforms (ab-) together with U2AF65 tags/high-confidence binding sites (horizontal lines/rectangles) identified by crosslinking and immunoprecipitation20. The 100 basewise vertebrate conservation by Phylop (100 VC) is at the bottom. The lower panel shows mutations (in red and underlined) introduced in the C-minigene. (b) Splicing pattern of wildtype and mutated C minigenes. Mutations are at the bottom of panel (a); RNA products are shown schematically to the right. The largest product produced by clone PE delPPT/AG includes the shortened pseudointron. (c) Splicing pattern of C minigenes mutated in NSE (lanes 2, 3, 7 and 8) or PE (lanes 4, 5, 9 and 10) in (mock)-depleted HEK293 cells. Mutations are at the bottom; their sequences are in Table S2. Spliced products are schematically shown to the right. A hairpin symbol above PE denotes the MIR stem-loop insertion; cr3’ss, a cryptic 3’ss activation 7 nt downstream of the authentic NSE 3’ss. (d,e) SSO-induced pseudoexon switching. Transfected minigenes are shown at the top, spliced products to the right and SSOs at the bottom. SSO sequences are in Table S1. Final concentration of SSOs shown in panels (d–g) was 3, 10 and 30 nM. (f) PE SSOs induced NSE skipping. (g) SSOs targeting a sequence that activates NSE upon deletion (PEdelPPT/AG; panel a and b) inhibit PE. (h) NSE activation is haplotype-dependent. Minigene haplotypes at the indicated variants are at the bottom. Columns represent mean NSE inclusion, error bars are SDs, asterisks denote statistically significant differences as in Fig. 1b./p>TG > TA./p>

G62, despite targeting U2AF binding sites (Fig. 4a). This suggests that the morpholino blocked access to structures or motifs that are not responsible for exon activation, but exon repression, in agreement with our finding (Fig. 1a–c). Thus, administration of antisense-based RNA processing activators or inhibitors that target or avoid binding sites of splicing factors in introns could be exploited therapeutically to shape beneficial or detrimental consequences of NMD in cancer cells./p>